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    生物样品透射电镜取材注意事项

    阅读次数:452  发布时间:2023/12/14 9:58:52
     
    生物样品透射电镜取材注意事项
    样品的取材与固定是生物电镜技术中关键的一步,样品的质量直接决定了
    电镜数据的质量。取材导致的结构差,后期实验中无法补救。对取材的基本要求
    是:确保样品尽可能接近自然生活状态,同时确保位置准确。不同的样品,取材
    细节上有较大区别。
    需要的器材:2.5%电镜用戊二醛、PBS 或生理盐水、锋利的手术刀、镊子、牙签、吸管、
    封口膜、细胞刮、离心机、切割板(光盘或塑料盘)、0℃碎冰(不要冰袋)、1.5ml 尖头
    ep 管、铅笔、记号笔。
    一、动物组织取材流程及要求
    取材流程:与时间赛跑,争分夺。
    1、试剂、容器、器械 4℃预冷,取材冰上操作(0℃碎冰,不要冻
    存的冰袋,无条件可室温)。提滴一些 2.5%戊二醛在切割板上;
    2、动物麻醉/处死,快速打开需要取材的位置。趁血液还在流动
    时,迅速切取一块组织,生理盐水或 PBS 快速冲洗后浸泡到切割
    板上的戊二醛中进一步切割;
    有方向性的样品:如肌丝、脊髓、肠道、血管等,沿着组织伸展
    方向切成 1mm*1mm*3mm 的长条,以便分辨方向。
    薄片状样品:如视网膜、粘膜等可以切的大一些 3mm*3mm 左右。
    无方向性的样品:选择位置准确的部位切成 1mm³小块,切记宁缺
    毋滥,保证取的每一块都是准确的。如:观察肾小球取肾皮质,
    观察肺泡避开气管取肺叶。
    有被膜的样品:去除被膜或者将被膜破孔方便渗透。样品大小尽量接近,不规则或稍大一点
    没关系。一定要避免修整样品时造成边缘组织机械损伤,这样反而效果不好。
    3、切的时候避免刀片对样品的挤压,应该拉刀法(斜着后拉动手术刀)切断,切样时,
    配合牙签轻轻拨动样品,将样品切成符合要求的形状。疏松多孔及柔软的样品可以大一些,
    避免样品溶解或压坏。后将样品用沾水的牙签粘入 1.5ml 尖头 EP 管。不要用镊子夹样品。
    加满 2.5%戊二醛。4℃避光保存。如果样品漂浮,可用纸或纱布将组织压到液面以下。
    4、取好的样品封口膜封口,气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触,防冻伤。
    注意事项:
    1、组间位置一致。同一器官不同部位的同种细胞,结构也有较大差异;
    2、器具锋利,柔软的组织要用手术刀轻轻拉断,尽量避免压断,保证切面锋利。
    3、冰上操作时,用制冰机的碎冰,如果没有碎冰,可以室温取材,冰袋易冻伤样品。
    4、取材速度,条件是灵活的,把握整体原理,不要刻意为了保证位置或大小,切坏了样品。
    尤其是要避免样品挤压以及冰袋冻坏样品
    关于灌注取材:
    灌注取材要求较高,尽量不要灌注。因为灌注不充分或者灌注方式不对(电镜样品用灌注
    法),反而会导致超微结构较差。直接取材时,严格操作,结构都不会太差。二、细胞细菌取材流程及要求
    贴壁细胞取材流程:
    1、请用 6cm-10cm 的培养皿培养细胞,方便后续操作;
    2、细胞倒掉培养液,加入恢复至室温的戊二醛固定液 2-3ml。
    3、细胞常温避光固定 5min 后,用细胞刮刀斜 45°朝一个方向快速铲下,
    保持一个方向,不要来回刮;
    4、得到的细胞悬液吸入离心管,离心(1500-3000rpm)3-5min,弃上清,
    然后加入新的 2.5%戊二醛固定液。如细胞无法成团,可加入 5ul 左右血
    清混合后再次离心,直至管底出现致密细胞团块。再次更换固定液后,
    室温避光固定 30min 后,4℃保存。细胞团块需要有绿豆大小,如图所示。
    太大的团块可用牙签挑成几块。
    5、取好的样品封口膜封口,气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触,防冻伤。
    悬浮细胞取材流程:
    细胞悬液离心(1500-3000rpm)3-5min,弃掉培养基后加入 2.5%戊二醛室温避光固定 30min,
    再转入 4℃保存,4℃冰袋运输。细胞团块需要有绿豆大小,如图所示。太大的团块可用牙
    签挑成几块。取好的样品封口膜封口,气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接
    触,防冻伤。
    细菌取材流程:
    1、固定培养的细菌:牙签挑取菌落置于室温 2.5%戊二醛,避光固定 30min。再转入 4℃保
    存,4℃冰袋运输。样品包裹厚一点,不要和冰袋直接接触,以免冻伤。细胞团块需要有绿
    豆大小,如图所示。太大的团块可用牙签挑成几块。
    2、悬浮培养的细菌:细菌悬液离心(5000-10000rpm)3-5min,弃掉培养基后加入 2.5%戊
    二醛室温避光固定 30min,再转入 4℃保存。细胞团块需要有绿豆大小,如图所示。4℃冰袋
    运输。取好的样品封口膜封口,气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触,防
    冻伤。
    注意事项:
    1、不要反复来回刮细胞,会造成细胞大量损伤;
    2、离心的目的是让细胞聚集成团,转速不可太高,会导致细胞变形;
    3、样品保存邮寄时,避免冻伤。
    三、外泌体、噬菌体、病毒、脂质体等:
    1、建议提供浓缩液至少 50ul,样品的纯度及浓度尽量高。
    2、保存及运输方式以样品结构性状稳定为要点。如:冻存的外泌体及病毒,不好反复冻融,
    所以建议干冰邮寄。新鲜提取的外泌体及噬菌体等,4℃可存放 3-5 天,所以样品可冰袋邮
    寄。部分样品可能在常温更能稳定保存其形态,即可常温邮寄。
    3、取好的样品封口膜封口,气泡膜包裹厚一点再邮寄。
    四、植物组织取材及要求
    取材流程:
    1、PBS 冲洗样品表面,去除泥沙等污染物。
    2、用锋利的手术刀或剪刀切割样品,切样时,可配合牙签轻轻拨动样品,将样品切成符合
    要求的形状,有方向的样品:如根尖、茎等,沿着组织伸展方向切成 1mm*1mm*3mm 的长条,
    以便分辨方向。薄片状样品可以切的大一些 3mm*3mm 左右。没有方向的样品切成 1mm³小块,
    切记宁缺毋滥,保证取的每一块都是准确的,如观察果皮就要去除果肉。观察果肉就要去除
    果皮。观察叶片就需要避开叶脉。有膜壳的样品要去除膜壳或者将膜壳破孔方便渗透;
    2、注意切割边缘整齐,去除机械损伤的位置。
    3、后将样品用沾水的牙签沾入 1.5ml 尖头 EP 管。加满 2.5%戊二醛。4℃避光保存。不要
    用镊子夹样品。如果样品漂浮,可用纸或纱布将组织压到液面以下。如果需要抽气,注意抽
    气的程度,太强烈可能会导致结构变化。
    4、取好的样品封口膜封口,气泡膜包裹厚一点再邮寄。样品不要和冰袋直接接触,防冻伤。
    注意事项:
    1、组间位置一致。同一器官不同部位的同种细胞,结构也有较大差异;
    2、样品大小尽量接近,不规则或稍大一点没关系。
    3、器具锋利,柔软的组织要用手术刀轻轻拉断,尽量避免压断,保证切面锋利。一定要避
    免修整样品时造成边缘组织机械损伤,这样反而效果不好。
    4、冰上操作时,用制冰机的碎冰,如果没有碎冰,可以室温取材,冰袋易冻伤样品。
    5、取材速度,条件是灵活的,把握整体原理,不要刻意为了保证位置或大小,切坏了样品。
    尤其是样品挤压以及冰袋冻坏样品
    五、样本储存运输标准
    储存:样本取材后,4℃避光保存时间好不超过 1 个月。
    运输:固定液充满 EP 管,封口膜封口。如下图,气泡膜或报纸包裹 7-8 层。纸质送样单+
    泡沫盒+冰袋的方式运输,冰袋 2-3 个(-20℃冰袋,不要太多,夏季 3-4 个),顺丰寄
    付。送样登记表电子版发给对接业务员。

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