| 本试剂盒仅供科研使用 中性蛋白酶（Neutral protease, NPT）试剂盒说明书 （货号：WS4140W 微板法 48 样） 一、产品简介： 蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，中性蛋白酶（NPT）是在中性条件下将酪 蛋白水解产生酪氨酸；酪氨酸与福林酚在碱性条件下反应生成蓝色化合物；该蓝色物质在 680nm 有特征 吸收峰，进而得中性蛋白酶活性， 由于底物酪蛋白自身含有多种氨基酸，所以在检测过程中必须设置带有底物酪蛋白的对照，以扣除有 干扰的背景值，排除假阳性。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格试剂名称 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×2 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 用甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 每瓶加入 3mL 试剂二 90℃加热搅拌至分散， 再加 12mL 提取液搅拌至溶解，后再加提 取液定容至 30mL,继续搅拌至全部溶解；配 置完的试剂 4℃保存，三天内用完。 试剂二 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 用摇匀 试剂三 液体 50mL×1 瓶 4℃保存 用摇匀 试剂四 液体 40mL×1 瓶 4℃保存 用摇匀 试剂五 液体 10mL×1 棕色瓶 4℃保存 现用现配，用甩几下或 4℃离心使试剂落入 试管底部，再加 20mL 蒸馏水， 4℃保存， 一星期内用完。 标准品 粉体 mg×1 支 EP 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 【注】：试剂一若在磁力搅拌器（带温控）上溶解，可用锡箔纸或保鲜膜盖住烧杯，以免溶解过程中水分蒸发过快。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、蒸馏水 四、中性蛋白酶（NPT）活性测定： 建议正式实验选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：测定管和对照管分别取约 0.1g 组织（水分充足的果实约 0.5g），加入 1mL 提 取液，进行冰浴匀浆；12000rpm，4℃离心 15min；取上清液待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/真菌样本：测定管和对照管分别取约 500 万细胞加入 1mL 提取液，冰浴超声波破 碎细胞（功率 300w，超声 3 ，间隔 7 ，总时间 3min）；12000rpm，4℃离心 15min； 取上清液待测。 【注】：若增加样本量，按细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 比例进行提取 ③ 液体样本：澄清液体直接检测；若浑浊则 12000rpm，4℃离心 15min；上清待测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 680nm，配制好的试剂一需预先 50℃水浴 10min。 ② 在 2mL 离心管中依次加入下列试剂培养： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 500 500 试剂一 500 40℃振荡培养 10min，同时，余下的试剂一须单独 40℃振荡培养 10min本试剂盒仅供科研使用 2 上歩单独 40℃培养的试剂一 500 试剂三 500 500 混匀，室温静置 10min，1500rpm（须准确），4℃离心 10min，上清液待用 ③ 显色反应：在 EP 管中依次加入： 上清液 250 250 试剂四 375 375 试剂五 250 250 40℃水浴 20min，取 200μL 澄清液（若浑浊，可 1500rpm 离心 10min） 至 96 孔板中，于 680nm 读取吸光值 A，△A=A 测定管-A 对照管。 【注】1.若△A 在零附近徘徊，可以加大样本量（如增加到 0.2g），或延长 40℃培养时间（如增加至 30min），或在显色反应阶段加大上清液体积（如，增加至 350μL，则试剂五相应减少），则改 变后的样本质量 W，反应时间 T 和显色步骤中的上清液体积 V1 需代入公式重新计算。 2.若测定管的 A 值大于 1.5，可减少样本取样量（如减少到 0.05g），或把上清液用蒸馏水进行稀 释，稀释倍数 D 代入公式参与计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0626x + 0.0011，x 是标准品质量（μg），y 是ΔA。 2、按照蛋白浓度计算： 活性单位定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生 1μg 酪氨酸为 1 个酶活单位。 NPT 活性(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0011)÷0.0626×(V3÷V2)÷(Cpr×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ÷Cpr×D 3、按照样本质量计算： 活性单位定义：40℃每克样品每分钟催化水解产生 1μg 酪氨酸为 1 个酶活单位。 NPT 活性(μg/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷(W×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ÷W×D 4、按照细胞数量计算： 活性单位定义：40℃每 104个细胞每分钟催化水解产生 1μg 酪氨酸为 1 个酶活单位。 NPT 活性(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷(细胞数量×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011)÷细胞数量×D 5、按液体体积计算： 活性单位定义：40℃每毫升液体样本每分钟催化水解产生 1μg 酪氨酸为 1 个酶活单位。 NPT 活性(μg/min/mL)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷V4÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ×D V－－-提取液体积，1mL； V1－－-样本体积，0.5mL； V2－－-显色步骤上清液体积，0.25mL； V3－－-培养步骤总反应体积，1.5mL； V4－－-液体样本，0.5mL； 酪氨酸分子量－－-181.19； T－－-反应时间，10min； W－－-样本质量，g； D－－-稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr－－-粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒检测。 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（100μg/mL）：标准品溶于 100mL 的 0.1mol/L 盐酸溶液中（两天内用完且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度标准品：0, 4, 8, 12, 16, 20. μg/mL。也可根据实际来调整标准品浓度。 3 依据测定管的显色反应阶段加样表依次加样，根据结果即可制作标准曲线。 更新时间：2024/1/23 8:49:57
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