| 本试剂盒仅供科研使用 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）试剂盒说明书 （货号：WS4011F 紫外分光法 24 样） 一、产品简介： Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是植物体内脯氨酸生物合成的关键酶，同时也是植 物在遭受胁迫时脯氨酸合成的限速酶；脯氨酸作为一种渗透调节物质，与植物对干旱和 盐胁迫的适应性密切相关。所以 P5CS 在调节脯氨酸的代谢水平上具有重要作用。 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）催化谷氨酸转化成γ-谷氨酸半醛，同时使 NADPH 氧化成 NADP+，通过检测 NADPH 在 340nm 处的下降速率，即可得出 P5CS 酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用甩几下，使粉体落到底部， 再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉体 mg×2 支 -20℃保存 临用甩几下，使粉体落到底部， 每支分别加入 0.6mL 蒸馏水溶解备 用，用不完的试剂分装后-20℃保 存，禁止反复冻融，三天内用完。 试剂三 液体 26mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉体 mg×2 支 4℃保存 临用甩几下，使粉体落到底部， 再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、水浴锅、离心机、可调式移液器、 研钵、冰和蒸馏水。 四、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性测定： 建议正式实验选取 2 个样本做预测定，了解本批样本情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： 1 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清 液待用。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清检测。 2、 上机检测： ① 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2 所有试剂解冻至室温（25℃）。 3 制备对照管样本：取出同一个样本的部分上清液至一新 EP 管中，于 95℃水浴中煮沸 10min 后取出，冷却至室温后于 12000rpm，4℃或者室温离心 10min，取离心后的上 清液作为该样本的对照管样本备用。本试剂盒仅供科研使用 2 4 在 1mL 石英比色皿（光径 1cm）中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 120 120（煮沸的样本） 试剂一 20 20 试剂二 20 20 试剂三 520 520 试剂四 20 20 混匀，室温（25℃）下，30s 时立即于 340nm 处分别读取吸光 值 A1，10min 后读取 A2，△A=（A1-A2）测定-（A1-A2）对 照（每个样本需做一个自身对照）。 【注】1.若ΔA 的值在零附近徘徊，则可延长反应时间 T（如增至 30min 或更长），或加大样本 量 V1（如增至 180μL，则试剂三相应减少），则改变后的反应（孵育）时间 T 或加 样体 积 V1 需代入计算公式重新计算。 2.若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对 会偏高），可以适当减少样本加样量（则试剂三相应增加），则改变后的加样体积需代 入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 P5CS 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=93.8×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 P5CS 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V) ÷T=93.8×ΔA÷W 3、按细菌/细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活单位（U）。 P5CS 活性(nmoL/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.188×△A 4、液体中 P5CS 活力的计算： 单位定义：每毫升液体在每分钟内氧化 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 P5CS 活性(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=93.8×ΔA V－－-提取液体积，1mL； V1－－-加入反应体系中样本体积，0.12mL； V2－－-反应体系总体积：7×10-4 L； d－－-光径，1cm； T－－-反应时间，10min； W－－-样本质量，g； ε－－-NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； Cpr－－-样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 更新时间：2024/3/7 10:06:58
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